(11)	027160 (13) B1	Разделы: A B C D E F G H
(21)	201490262
(22)	2012.08.13
(51)	C07K 16/00 (2006.01)
(31)	61/524,488; 1121226.3; 1121233.9; 1121236.2; PCT/EP2012/064632
(32)	2011.08.17; 2011.12.12; 2011.12.12; 2011.12.12; 2012.07.25
(33)	US; GB; GB; GB; EP
(43)	2014.09.30
(86)	PCT/EP2012/065782
(87)	WO 2013/024059 2013.02.21
(71)	(73) ГЛАКСО ГРУП ЛИМИТЕД (GB)
(72)	Эшмэн Клер (GB), Берчлер Мэри (US), Де Вилдт Рудольф М Т (GB), Холланд Клер (US), Льюис Алан Питер, Морли Питер, Сандал Томас, Стюард Майкл (GB)
(74)	Поликарпов А.В. (RU)
(54)	МОДИФИЦИРОВАННЫЕ БЕЛКИ И ПЕПТИДЫ

(57) 1. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина (dAb), который выбран из группы, состоящей из человеческого V_H dAb, человеческого V_L dAb (например, V каппа) и V_HH камелида, и который моновалентно связывается с антигеном-мишенью, содержащий:

а) три определяющие комплементарность области (CDR), специфичные в отношении указанного антигена-мишени, так что указанный dAb связывается с указанным антигеном с K_D (равновесная константа диссоциации) в пределах от 5 мкМ до 1 пМ;

б) четыре каркасные (FW) области;

в) C-концевую последовательность, состоящую из последовательности VTVS(S)_nX или VEIK_pR_qX; и возможно

г) одну или более чем одну аминокислотную замену в положениях 14, 41, 108, 110 или 112 по сравнению с человеческой каркасной последовательностью эмбрионального типа,

где n представляет собой целое число, независимо выбранное из 0 или 1;

каждое из р и q представляет собой 0 или 1, таким образом, что, когда р представляет собой 1, q может представлять собой 0 или 1, и, таким образом, что, когда р представляет собой 0, q также представляет собой 0;

X может присутствовать или отсутствовать, и, если присутствует, представляет собой аминокислотное удлинение на 1-5 аминокислотных остатков;

при дополнительном условии, что, если X отсутствует:

(1) n представляет собой 0, и/или dAb, оканчивающийся VTVS(S)_n, содержит одну или более чем одну из указанных аминокислотных замен;

(2) р и/или q представляют собой 0, и/или dAb, оканчивающийся VEIK_pR_q, содержит одну или более чем одну из указанных аминокислотных замен.

2. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина (dAb)

который выбран из группы, состоящей из человеческого V_H dAb, человеческого V_L dAb (например, V каппа) и V_HH камелида;

который содержит одну или более чем одну модификацию, выбранную из:

(а) C-концевого удлинения, которое содержит аминокислотное удлинение размером от 1 аминокислоты до 5 аминокислот; или

(б) одной или более чем одной замены аминокислот каркасной области, где по меньшей мере одна замена представляет собой замену, выбранную из замены Р14А, замены Р41А и замены L108A;

(в) C-концевой делеции; и

который обладает уменьшенным связыванием с предсуществующими ADA (антитела против лекарственного средства) по сравнению с немодифицированным единичным вариабельным доменом иммуноглобулина (dAb).

3. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина по п.1 или 2, где:

(1) когда указанный единичный вариабельный домен иммуноглобулина представляет собой человеческий V_H или V_HH камелид, тогда указанное C-концевое удлинение содержит или состоит из аминокислотного удлинения, выбранного из (а) А, (б) AS, (в) AST, (г) ASTK, (д) ASTKG, (е) ААА или (ж) Т, или содержит C-концевую делецию, которая представляет собой -S делецию; и

(2) когда указанный единичный вариабельный домен иммуноглобулина представляет собой человеческий V_L, такой как V каппа, тогда указанное C-концевое удлинение содержит или состоит из аминокислотного удлинения, выбранного из (а) ААА, (б) А, (в) TV и (г) Т, или содержит C-концевую делецию, которая представляет собой -R делецию; или

единичный вариабельный домен иммуноглобулина, где указанная одна или более чем одна аминокислотная замена выбрана из группы, состоящей из замены Р14А, замены Р41А, замены L108A, замены Т110А и замены S112A.

4. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина (dAb) по любому из пп.1-3, который связывается с мишенью, выбранной из рецептора, полимерной мишени, TNFα (фактор некроза опухоли альфа), рецептора TNF, TNF рецептора 1 (TNFR1), VEGF (фактор роста эндотелия сосудов), IL-1R (интерлейкин 1R), IL-6R, IL-4, IL-5, IL-13, DC-SIGN (специфический для дендритных клеток ICAM-3 (молекула межклеточной адгезии-3)-захватывающий неинтегрин), ASGPR (асиалогликопротеиновый рецептор), альбумина, фактора фон Виллебранда, домена А1 фактора фон Виллебранда и TGFβR2 (рецептор R2 трансформирующего фактора роста бета).

5. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина (dAb) по п.4, где мишень представляет собой TNFR1, и dAb выбран из любой из следующих аминокислотных последовательностей, идентифицированных как (a) DOM 1H-131-206 dAb с удлинением на единичный аланин на C-конце (представленной на фиг. 8а: SEQ ID NO: 16); (б) DOM 1H-131-206 dAb с удлинением на единичный аланин на C-конце и мутацией Р14А в каркасной области (представленной на фиг. 8b: SEQ ID NO: 17); (в) DOM 1H-131-206 dAb с мутацией Р14А в каркасной области (представленной на фиг. 8с: SEQ ID NO: 18); (г) DOM 1H-131-206 dAb с удлинением ASTKG на C-конце (представленной на фиг. 8d: SEQ ID NO: 19) и (д) DOM 1H-131-206 dAb с удлинением ASTKG на C-конце и мутацией Р14А в каркасной области (представленной на фиг. 8е: SEQ ID NO: 20).

6. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина (dAb) по любому из пп.4, 5, где мишень представляет собой TNFR1, и немодифицированный dAb выбран из аминокислотной последовательности, которая на 100, 99,5, 99, 98, 97, 96, 95, 90, 85 или 80% идентична любой из аминокислотных последовательностей, идентифицированных как DOM 1H-131-206 (представленная на фиг. 2а: SEQ ID NO: 1), DOM 1H-131-511 (представленная на фиг. 2b: SEQ ID NO: 2), DOM 1H-131-202 (представленная на фиг. 2с: SEQ ID NO: 3).

7. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина (dAb) по любому из пп.1-6, где dAb представлен в виде слияния или конъюгата с дополнительными молекулами, выбранными из дополнительного dAb или белка, или полипептида или его фрагмента, белка или полипептида, или его фрагмента, который может увеличивать период полувыведения или представляет собой дополнительную терапевтическую или активную молекулу, молекулы PEG (полиэтиленгликоль), антитела или его фрагмента или области Fc.

8. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина (dAb) по любому из пп.1-7, где dAb представлен в виде молекулы mAbdAb, в виде линейного слияния или в форме гантели.

9. Фармацевтическая композиция, содержащая единичный вариабельный домен иммуноглобулина (dAb) по любому из пп.1-8 в комбинации с фармацевтически или физиологически приемлемым носителем, эксципиентом или разбавителем.

10. Применение единичного вариабельного домена иммуноглобулина по любому из пп.1-8 в способе предупреждения побочных эффектов.

11. Применение единичного вариабельного домена иммуноглобулина по любому из пп.1-8 в медицине.

12. Применение фармацевтической композиции, содержащей (dAb) по п.5 или 6, в лечении или предупреждении по меньшей мере одного заболевания или расстройства либо состояния, выбранного из воспалительного заболевания или расстройства, или респираторного заболевания или расстройства, или легочного заболевания или расстройства.

13. Применение единичного вариабельного домена иммуноглобулина (dAb) по п.5, который представляет собой DOM 1H-131-206 dAb с удлинением на единичный аланин на C-конце (с аминокислотной последовательностью, представленной на фиг. 8а: SEQ ID NO: 16), в лечении или предупреждении по меньшей мере одного заболевания или расстройства либо состояния, которое выбрано из артрита, псориаза, рассеянного склероза, воспалительного заболевания кишечника, например болезни Крона и неспецифического язвенного колита или, например, респираторных или легочных заболеваний или расстройств, например, выбранных из астмы, хронического обструктивного заболевания легких, хронического бронхита, хронического обструктивного бронхита и эмфиземы, воспаления легких, хронического обструктивного заболевания легких, астмы, пневмонии, гиперчувствительного пневмонита, легочного инфильтрата с эозинофилией, заболевания легких, связанного с влиянием окружающей среды, пневмонии, бронхоэктаза, муковисцидоза, интерстициального заболевания легких, первичной легочной гипертензии, легочной тромбоэмболии, расстройств плевры, расстройств средостения, расстройств диафрагмы, гиповентиляции, гипервентиляции, апноэ во время сна, острого респираторного дистресс-синдрома, мезотелиомы, саркомы, отторжения трансплантата, заболевания "трансплантат против хозяина", рака легких, аллергического ринита, аллергии, асбестоза, аспергилломы, аспергиллоза, бронхоэктаза, хронического бронхита, эмфиземы, эозинофильной пневмонии, идиопатического легочного фиброза, инвазивного пневмококкового заболевания, гриппа, нетуберкулезных микобактерий, плеврального выпота, пневмокониоза, пневмоцитоза, пневмонии, легочного актиномикоза, легочного альвеолярного протеиноза, легочной сибирской язвы, отека легких, легочной эмболы, воспаления легких, легочного гистиоцитоза X, легочной гипертензии, легочного нокардиоза, туберкулеза легких, веноокклюзионной болезни легких, ревматоидной болезни легких, саркоидоза и гранулематоза Вегенера и острого повреждения легких (ALI) и острого респираторного дистресс-синдрома (ARDS) и их осложнений.

14. Инъецируемый, пероральный, ингалируемый или распыляемый препарат, или препарат с длительным высвобождением, или лиофилизированный препарат, который содержит композицию или dAb по любому из пп.1-9.

15. Устройство для доставки, содержащее dAb по любому из пп.1-8.

16. Выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая dAb по любому из пп.1-8.

17. Выделенная рекомбинантная нуклеиновая кислота, имеющая нуклеиново-кислотную последовательность, представленную на фиг. 9b (SEQ ID NO: 22) и кодирующую DOM 1H-131-206 dAb с удлинением на единичный аланин.