Евразийский сервер публикаций

Евразийский патент № 039511

   Библиографические данные
(11)039511    (13) B1
(21)201791681

 A ]   B ]   C ]   D ]   E ]   F ]   G ]   H ] 

Текущий раздел: C     


Документ опубликован 2022.02.04
Текущий бюллетень: 2022-02  
Все публикации: 039511  
Реестр евразийского патента: 039511  

(22)2016.01.27
(51) C12N 15/89 (2006.01)
C12N 15/84(2006.01)
(43)A1 2018.03.30 Бюллетень № 03  тит.лист, описание 
(45)B1 2022.02.04 Бюллетень № 02  тит.лист, описание  последовательности 
(31)201510040078.0
(32)2015.01.27
(33)CN
(86)CN2016/072352
(87)2016/119703 2016.08.04
(71)ИНСТИТЬЮТ ОФ ДЖЕНЕТИКС ЭНД ДЕВЕЛОПМЕНТАЛ БАЙОЛОДЖИ, ЧАЙНИЗ АКЭДЕМИ ОФ САЙЕНСИЗ (CN)
(72)Гао Каиксиа, Жанг Йи, Ву Жонгуи, Жанг Кэнг (CN)
(73)ИНСТИТЬЮТ ОФ ДЖЕНЕТИКС ЭНД ДЕВЕЛОПМЕНТАЛ БАЙОЛОДЖИ, ЧАЙНИЗ АКЭДЕМИ ОФ САЙЕНСИЗ (CN)
(74)Вашук Т.В., Емельянова В.А., Королева С.В., Кудашов В.И. (BY)
(54)СПОСОБ САЙТ-НАПРАВЛЕННОЙ МОДИФИКАЦИИ ЦЕЛОГО РАСТЕНИЯ ПОСРЕДСТВОМ ТРАНЗИЕНТНОЙ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА
   Формула 
(57) 1. Способ создания мутантного нетрансгенного растения, состоящий из следующих этапов:
транзиентной экспрессии последовательность-специфической нуклеазы в растении, характеризующейся тем, что в качестве объекта используется целое растение, и включающий:
a) введения последовательность-специфической нуклеазы CRISPR-ассоциированной системы, которая расщепляет целевой фрагмент с достижением сайт-направленной модификации посредством саморепарации ДНК растения или генетического материала для экспрессии указанной последовательность-специфической нуклеазы в растение через пыльцевую трубку, соцветие, стеблевой апекс или завязь, и
b) выращивания растения, получаемого на этапе a), в отсутствие селективного давления, при этом последовательность-специфическая нуклеаза или генетический материал, не интегрировавшийся в хромосому растения, деградируется, таким образом, напрямую получая нетрансгенное T1 мутантное растение, содержащее сайт-направленную модификацию на уровне непосредственно целого растения, при этом отсутствует этап культивирования тканей;
при этом генетический материал представляет собой рекомбинантный вектор или линейный фрагмент ДНК, либо РНК, транскрибированную in vitro.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что последовательность-специфическая нуклеаза или генетический материал вводится через
a) пыльцевую трубку, введение осуществляют путем инъекции раствора, содержащего рекомбинантный вектор или линейный фрагмент ДНК, либо РНК, транскрибированную in vitro, или раствора, содержащего последовательность-специфическую нуклеазу, в рыльце после опыления;
b) соцветие, введение осуществляют путем погружения соцветия в раствор Agrobacterium tumefaciens, несущий рекомбинантный вектор или линейный фрагмент ДНК.
c) стеблевой апекс, введение осуществляют путем погружения стеблевого апекса в раствор Agrobacterium tumefaciens, несущий рекомбинантный вектор или линейный фрагмент ДНК.
d) завязь, введение осуществляют путем инъекции раствора, содержащего рекомбинантный вектор или линейный фрагмент ДНК, либо РНК, транскрибированную in vitro, или раствор, содержащий последовательность-специфическую нуклеазу, в завязь после опыления, либо путем инъекции раствора Agrobacterium tumefaciens, несущего рекомбинантный вектор или линейный фрагмент ДНК, в завязь после опыления.
3. Способ по любому из пп.1-2, отличающийся тем, что последовательность-специфическая нуклеаза CRISPR-ассоциированных систем представляет собой нуклеазу CRISPR/Cas9, генетический материал включает рекомбинантный вектор или фрагмент ДНК, способный транскрибировать направляющую РНК и экспрессировать белок Cas9; либо генетический материал включает рекомбинантный вектор или фрагмент ДНК, способный транскрибировать направляющую РНК, и рекомбинантный вектор или фрагмент ДНК, либо РНК, способные экспрессировать белок Cas9; либо генетический материал включает направляющую РНК, и рекомбинантный вектор или фрагмент ДНК, либо РНК, способные экспрессировать белок Cas9; при этом направляющая РНК представляет собой РНК палиндромной структуры, образующуюся путем частичного спаривания оснований между crPHK и tracrPHK, и crPHK содержит фрагмент РНК, способный комплементарно связываться с целевым фрагментом.
4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что сайт-направленная модификация представляет собой инсерцию, делецию и/или мутационную замену в целевом фрагменте.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в растении, получаемом на этапе b) функции гена-мишени утеряны и его геном свободен от интегрированного экзогенного гена.
6. Способ по любому из пп.1-5, отличающиеся тем, что растение представляет собой растение любого генотипа.
7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что растение выбирают из группы, включающей кукурузу, пшеницу, сою, хлопок, табак, Arabidopsis, рожь, Rosa roxbunghii, Eriobotrya japonica, Carica papaya, Rosa canina, Dendrobium nobile Lindl., Brassica oleracea, Fagopyrum tataricum и Hevea brasiliensis.
8. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что растение представляет собой кукурузу, последовательность-специфическая нуклеаза представляет собой нуклеазу CRISPR/Cas9, ген-мишень представляет собой ZmIPK.
9. Способ по п.8, отличающийся тем, что целевой фрагмент представляет собой 5'-AGCTCGACCACGCCGCCGAC-3'; рекомбинантный вектор для транскрипции направляющей РНК получают путем инсерции фрагмента ДНК, представляющего собой 5'-AGCAGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3', между двумя сайтами рестрикции BbsI плазмиды pZmU3-gRNA; и рекомбинантный вектор для экспрессии нуклеазы CRISPR/Cas9 представляет собой pJIT163-Ubi-Cas9.
10. Способ по п.8, отличающийся тем, что целевой фрагмент представляет собой 5'-AGCTCGACCACGCCGCCGAC-3'; рекомбинантный вектор для транскрипции направляющей РНК и экспрессии нуклеазы CRISPR/Cas9 получают путем инсерции фрагмента ДНК, представляющего собой 5'-AGCAGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3', между двумя сайтами рестрикции BbsI плазмиды pBUE411.
11. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что растение представляет собой Arabidopsis, последовательность-специфическая нуклеаза представляет собой нуклеазу CRISPR/Cas9, ген-мишень представляет собой AtPTPA.
12. Способ по п.11, отличающийся тем, что целевой фрагмент представляет собой 5'-AGCTCGACCACGCCGCCGAC-3'; рекомбинантный вектор для транскрипции направляющей РНК и экспрессии нуклеазы CRISPR/Cas9 получают путем инсерции фрагмента ДНК, представляющего собой 5'-ATTGGTGAAATCGGCGGATATCGT-3', между двумя сайтами рестрикции BsaI плазмиды pHSN401.