Евразийский сервер публикаций

Евразийский патент № 045221

   Библиографические данные
(11)045221    (13) B1
(21)202091501

 A ]   B ]   C ]   D ]   E ]   F ]   G ]   H ] 

Текущий раздел:      


Документ опубликован 2023.11.03
Текущий бюллетень: 2023-11  
Все публикации: 045221  
Реестр евразийского патента: 045221  

(22)2018.12.19
(51) B01D 15/38 (2006.01)
B01J 20/286 (2006.01)
B01J 20/32 (2006.01)
C12Q 1/6886(2018.01)
(43)A1 2020.09.21 Бюллетень № 09  тит.лист, описание  последовательности 
(45)B1 2023.11.03 Бюллетень № 11  тит.лист, описание  последовательности 
(31)102017000146281
(32)2017.12.19
(33)IT
(86)EP2018/085974
(87)2019/122003 2019.06.27
(71)ЭДВАНСТ ЭКСТРАСЕЛЛУЛАР ВЕСИКЛ ЭППЛИКЕЙШНЗ С.Р.Л. (IT)
(72)Д'Агостино Вито Джузеппе, Провенцани Алессандро, Куатроне Алессандро, Цукал Кьяра, Нотаранджело Микела, Модельска Анджелика, Пеше Изабелла (IT)
(73)ЭДВАНСТ ЭКСТРАСЕЛЛУЛАР ВЕСИКЛ ЭППЛИКЕЙШНЗ С.Р.Л. (IT)
(74)Фелицына С.Б. (RU)
(54)НЕПОДВИЖНАЯ ФАЗА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ВЕЗИКУЛ, СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ
   Формула 
(57) 1. Неподвижная фаза для выделения внеклеточных везикул (ВВ), секретируемых эукариотическими или прокариотическими клетками в биологической жидкости, где указанная неподвижная фаза функционализирована катионами, выбранными из группы, состоящей из никеля и алюминия, имеет дзета-потенциал от 30 до 80 мВ, состоит из магнитных или немагнитных частиц микрометрического или нанометрического размера и выбрана из группы, состоящей из гранул, изготовленных из агарозы, кремния, альгинатных солевых матриц, полимеров для металл-аффинной хроматографии с иммобилизованными ионами металлов (IMAC), никелевого хелатного акцептора, анионных или углеродных стирольных полимеров.
2. Неподвижная фаза по п.1, являющаяся агарозными гранулами с частицами, имеющими средний размер 25-40 мкм, если размер является микрометровым.
3. Способ получения функционализированной неподвижной фазы по любому из пп.1, 2, включающий суспендирование нефункционализированной неподвижной фазы в солевом буферном растворе с физиологическим значением рН, содержащем 15-100 мМ соли никеля или алюминия.
4. Способ по п.3, где солевой буферный раствор с физиологическим значением рН представляет собой фосфатно-солевой буферный раствор (ФБР) или любой другой буфер с физиологическим рН.
5. Способ по любому из пп.3, 4, где суспензию инкубируют при комнатной температуре при круговом вращении при 300-600 об/мин.
6. Применение неподвижной фазы по любому из пп.1, 2 для выделения внеклеточных везикул (ВВ), секретируемых эукариотическими или прокариотическими клетками, в биологической жидкости.
7. Способ выделения внеклеточных везикул (ВВ), секретируемых эукариотическими или прокариотическими клетками в биологической жидкости, включающий добавление по каплям на поверхность биологической жидкости суспензии гранул с неподвижной фазой по любому из пп.1, 2, причем указанная суспензия находится в солевом растворе, забуференном при физиологическом рН,
инкубирование гранул в биологической жидкости и последующее разделение путем мягкого центрифугирования и декантации,
удаление ВВ с гранул путем инкубации, по меньшей мере, в равном объеме элюирующего раствора, который приготовлен перед использованием путем смешивания двух физиологических растворов с физиологическим рН, содержащих по меньшей мере два разных хелатирующих агента.
8. Способ по п.7, где хелатирующие агенты выбраны из группы, состоящей из ЭДТА и цитрата натрия.
9. Способ по п.7, где в конечном элюирующем растворе ЭДТА имеет концентрацию 3-6 мМ, а цитрат натрия имеет концентрацию 30-300 мкМ.
10. Способ по любому из пп.7-9, где инкубацию с элюирующим раствором поддерживают при круговом вращении при 20-37°С.
11. Способ по любому из пп.7-10, где биологическая жидкость выбрана из группы, состоящей из сред для культивирования клеток, физиологических буферных растворов, сред для бактериальных культур, крови человека и животных, экссудатов тканей человека и животных.
12. Способ, включающий подвергание ВВ, выделенных способом по любому из пп.7-11, протоколам для экстракции белка и нуклеиновых кислот из ВВ, технологиям обнаружения антигена в сочетании со специфическими антителами, детекции и количественному определению ассоциированных и/или содержащихся в везикулах нуклеиновых кислот с помощью ОТ-ПЦР, детекции и количественному определению ассоциированных и/или содержащихся в везикулах нуклеиновых кислот с помощью капельной цифровой ПЦР.
13. Набор для выделения внеклеточных везикул (ВВ), секретируемых эукариотическими или прокариотическими клетками, в биологической жидкости, включающий
контейнер, содержащий неподвижную фазу по любому из пп.1, 2, или
контейнер, содержащий нефункционализированную неподвижную фазу, состоящую из магнитных и немагнитных частиц микрометрового или нанометрового размера, при этом неподвижная фаза выбрана из группы, состоящей из гранул, изготовленных из агарозы, кремния, альгинатных солевых матриц, полимеров для металл-аффинной хроматографии с иммобилизованными ионами металлов (IMAC), никелевого хелатного акцептора, анионных или углеродных стирольных полимеров, и
контейнер, содержащий соль никеля или алюминия.
14. Набор для выделения внеклеточных везикул (ВВ), секретируемых эукариотическими или прокариотическими клетками, в биологической жидкости, включающий
контейнер, содержащий нефункционализированную неподвижную фазу, состоящую из магнитных и немагнитных частиц микрометрового или нанометрового размера; при этом неподвижная фаза выбрана из группы, состоящей из гранул, изготовленных из агарозы, кремния, альгинатных солевых матриц, полимеров для аффинной хроматографии с иммобилизованными ионами металлов (IMAC), никелевого хелатного акцептора, анионных или углеродных стирольных полимеров; и
контейнер, содержащий соль никеля или алюминия.
15. Набор по п.13 или 14, дополнительно включающий
контейнер, содержащий солевой буферный раствор с физиологическим значением рН,
по меньшей мере два контейнера, содержащих различные хелатирующие агенты.