Евразийский сервер публикаций

Евразийский патент № 045290

   Библиографические данные
(11)045290    (13) B1
(21)202092792

 A ]   B ]   C ]   D ]   E ]   F ]   G ]   H ] 

Текущий раздел: C     


Документ опубликован 2023.11.14
Текущий бюллетень: 2023-11  
Все публикации: 045290  
Реестр евразийского патента: 045290  

(22)2019.05.21
(51) C12N 9/10 (2006.01)
C12P 33/00 (2006.01)
C12N 15/52 (2006.01)
C12P 1/00(2006.01)
(43)A1 2021.04.02 Бюллетень № 04  тит.лист, описание  последовательности 
(45)B1 2023.11.14 Бюллетень № 11  тит.лист, описание  последовательности 
(31)00628/18
(32)2018.05.22
(33)CH
(86)EP2019/063078
(87)2019/224188 2019.11.28
(71)ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. (NL)
(72)Леманн Отто Мартин (CH), Пихлер Гаральд, Штольтерфот Холли (AT)
(73)ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. (NL)
(74)Фелицына С.Б. (RU)
(54)МОДИФИЦИРОВАННЫЕ СТЕРОЛ-АЦИЛТРАНСФЕРАЗЫ
   Формула 
(57) 1. Фермент, выбранный из ЕС 2.3.1.26, обладающий стерол-ацилтрансферазной активностью, содержащий одну или несколько аминокислотных замен в положениях, соответствующих остаткам 11, 281, 366, 442, 551, 554, 572, 624, 626, 627, 636 и их комбинаций в полипептиде по SEQ ID NO: 1, где одна или несколько аминокислотных замен выбраны из группы, состоящей из E11G, L281I, D366V, I442V, H551Y, H554Q, F572L, F624L, L626F, G627D, C636S и их комбинациий.
2. Фермент по п.1, катализирующий эстерификацию стеролов, содержащих 7-дегидрохолестерин (7-DHC) и зимостерол, причем соотношение 7-DHC к зимостеролу в сложных эфирах стеролов повышается по меньшей мере в 1,4 раза по сравнению с соотношением 7-DHC к зимостеролу при катализе с использованием соответствующего фермента, где аминокислоты в положениях, соответствующих положениям 11, 281, 366, 442, 551, 554, 572, 624, 626, 627, 636, и их комбинации в полипептиде в соответствии с SEQ ID NO: 1 выбраны из группы, состоящей из 11Е, 281L, 366D, 442V, 551H, 554Н, 572F, 624F, 626F, 627G, 636С и их комбинации.
3. Фермент по п.1 или 2, в котором аминокислотные замены выбраны из F624L, G627D, E11G, H554Q, I442V и их комбинаций.
4. Клетка дрожжей, вырабатывающая стеролы, содержащая модифицированный фермент по любому из пп.1-3.
5. Клетка дрожжей по п.4, в которой полипептид с последовательностью SEQ ID NO: 3 дополнительно содержит одну или несколько аминокислотных замен в положениях, соответствующих остаткам 592 и/или 595, выбранных из F592L и/или G595D.
6. Клетка дрожжей по п.4 или 5 для получения смеси стеролов, содержащей 7-DHC и зимостерол, причем соотношение 7-DHC к зимостеролу повышается по меньшей мере в 1,4 раза по сравнению с клеткой дрожжей, экспрессирующей соответствующий фермент, где (1) аминокислоты в положениях, соответствующих положениям 11, 281, 366, 442, 551, 554, 572, 624, 626, 627, 636, и их комбинации в полипептиде в соответствии с SEQ ID NO: 1 выбраны из группы, состоящей из 11Е, 281L, 366D, 442V, 551H, 554Н, 572F, 624F, 626F, 627G, 636С и их комбинаций.
7. Клетка дрожжей по любому из пп.4-6, в которой инактивированы ERG5, кодирующий С-22 стеролдесатуразу, и ERG6, кодирующий стерол 24-С-метилтрансферазу.
8. Клетка дрожжей по любому из пп.4-7, экспрессирующая гетерологичный фермент из числа ЕС 1.3.1.72, обладающий активностью D24-стеролредуктазы.
9. Способ снижения содержания зимостерола в смеси стеролов, содержащей зимостерол и 7-DHC, включающий культивирование клеток хозяина по любому из пп.4-8 в соответствующих условиях.
10. Способ повышения содержания 7-DHC в смеси стеролов, содержащей 7-DHC и зимостерол, включающий культивирование клеток хозяина по любому из пп.4-8 в соответствующих условиях.
11. Способ получения 7-DHC, включающий ферментативное превращение ацетил-СоА в смесь стеролов, содержащую зимостерол и 7-DHC, используя клетки хозяина по любому из пп.4-8, причем содержание 7-DHC в смеси стеролов составляет по меньшей мере 40%.
12. Способ по п.11, при этом 7-DHC дополнительно превращается в витамин D3.
13. Способ по п.11 или 12, при этом 7-DHC дополнительно превращается в 25-гидроксивитамин D3.
14. Применение клетки дрожжей по любому из пп.4-8 в способе получения 7-DHC, причем 7-DHC выделяют из смеси стеролов, содержащей зимостерол и 7-DHC, а соотношение 7-DHC к зимостеролу повышается по меньшей мере в 1,4 раза по сравнению со способом с использованием соответствующего немодифицированного фермента и немодифицированных клеток хозяина, соответственно.