Евразийский сервер публикаций

Евразийский патент № 045304

   Библиографические данные
(11)045304    (13) B1
(21)202191828

 A ]   B ]   C ]   D ]   E ]   F ]   G ]   H ] 

Текущий раздел: C     


Документ опубликован 2023.11.15
Текущий бюллетень: 2023-11  
Все публикации: 045304  
Реестр евразийского патента: 045304  

(22)2019.02.18
(51) C07K 14/415 (2006.01)
C12N 15/82 (2006.01)
A01H 5/06 (2018.01)
A01H 6/02(2018.01)
(43)A1 2021.08.12 Бюллетень № 08  тит.лист, описание  последовательности 
(45)B1 2023.11.15 Бюллетень № 11  тит.лист, описание  последовательности 
(86)EP2019/054008
(87)2020/169178 2020.08.27
(71)КВС ЗААТ СЕ & КО. КГАА (DE)
(72)Торьек Отто, Борхардт Дитрих (DE), Рекоске Маргарет (US), Мехельке Вольфганг, Лайн Дженс Кристоф, Шульц Бритта (DE)
(73)КВС ЗААТ СЕ & КО. КГАА (DE)
(74)Зуйков С.А. (RU)
(54)ГЕН УСТОЙЧИВОСТИ К БОЛЕЗНЯМ РАСТЕНИЙ
   Формула 
(57) 1. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, который способен придавать устойчивость к Cercospora beticola растению, в котором экспрессируется полипептид, отличающаяся тем, что молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая выбрана из
(a) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 3;
(b) нуклеотидной последовательности, содержащей последовательность ДНК в соответствии с SEQ ID NO: 2;
(c) нуклеотидной последовательности, содержащей последовательность ДНК в соответствии с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 53;
(f) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 3.
(g) нуклеотидной последовательности, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности ДНК в соответствии с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2;
при этом растение относится к подвиду Beta vulgaris subsp. vulgaris.
2. Полипептид, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты по п.1.
3. Вектор или кассета экспрессии, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п.1.
4. Клетка, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п.1 или полипептид по п.2.
5. Устойчивое к Cercospora beticola растение или его часть, отличающееся тем, что растение или его часть содержит молекулу нуклеиновой кислоты по п.1, при этом растение, содержащее молекулу нуклеиновой кислоты, относится к подвиду Beta vulgaris subsp. vulgaris.
6. Семя растения по п.5, отличающееся тем, что семя содержит молекулу нуклеиновой кислоты по п.1.
7. Потомок растения по п.5, отличающийся тем, что потомок содержит молекулу нуклеиновой кислоты по п.1.
8. Семя, прошедшее техническую обработку, по п.6, отличающееся тем, что техническая обработка выбрана из группы, состоящей из:
(а) полировки,
(b) протравливания, дражирования,
(c) инкрустации,
(d) окрашивания.
9. Способ повышения устойчивости растения подвида Beta vulgaris subsp. vulgaris к Cercospora beticola, включающий следующие этапы:
(i) интеграцию молекулы нуклеиновой кислоты по п.1 посредством гомологически направленной репарации или гомологической рекомбинации; или
(ii) повышение экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты по п.1 в растении; или
(iii) повышение активности и/или стабильности полипептида по п.2 посредством модификации нуклеотидной последовательности молекулы нуклеиновой кислоты по п.1; или
(iv) трансформацию растительной клетки с молекулой нуклеиновой кислоты по п.1, или вектором, или кассетой экспрессии по п.3, и регенерацию трансгенного растения из трансформированной растительной клетки.
10. Способ повышения устойчивости по п.9, который включает этап
(i) интеграцию молекулы нуклеиновой кислоты по п.1 посредством гомологически направленной репарации или гомологической рекомбинации стимулируемой сайт-направленной нуклеазой - в геном по меньшей мере одной клетки растения подвида Beta vulgaris subsp. vulgaris.
11. Способ повышения устойчивости по п.10, который на этапе (i) включает регенерацию растения из растительной клетки.
12. Способ повышения устойчивости по п.9, который включает этап
(ii) повышение экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты по п.1 в растении, посредством модификации нативного промотора в соответствии с SEQ ID NO: 7 или посредством слияния молекулы нуклеиновой кислоты с гетерологичным промотором, который демонстрирует более высокую активность по сравнению с нативным промотором - в частности, после заражения Cercospora beticola.
13. Способ повышения устойчивости по п.12, который включает этап
(ii) повышение экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты по п.1 в растении, посредством модификации нативного промотора в соответствии с SEQ ID NO: 7 или посредством слияния молекулы нуклеиновой кислоты с гетерологичным промотором, который демонстрирует более высокую активность по сравнению с нативным промотором после заражения Cercospora beticola.
14. Способ продуцирования растения, устойчивого к Cercospora beticola, по п.5, включающий следующие этапы:
(Ia) трансформацию растительной клетки с молекулой нуклеиновой кислоты по п.1, или вектором, или кассетой экспрессии по п.3; и
(Ib) регенерацию трансгенного растения из трансформированной растительной клетки; или
(IIa) введение сайт-направленной нуклеазы и репарационной матрицы в клетку растения рода Beta vulgaris, отличающийся тем, что сайт-направленная нуклеаза способна генерировать по меньшей мере один двухцепочечный разрыв ДНК в геноме клетки, и репарационная матрица содержит молекулу нуклеиновой кислоты по п.1;
(IIb) культивирование клетки из этапа (IIa) в условиях, допускающих гомологически направленную репарацию или гомологическую рекомбинацию, при этом молекула нуклеиновой кислоты интегрирована из репарационной матрицы в геном растения; и
(IIc) регенерацию растения из клетки, модифицированной на этапе (b).
15. Способ по п.14, отличающийся тем, что по меньшей мере один двухцепочечный разрыв происходит в чувствительном аллельном варианте молекулы нуклеиновой кислоты по п.1, или тем, что по меньшей мере один двухцепочечный разрыв происходит в положении, охватывающем не более 10000 пар оснований выше или ниже чувствительного аллельного варианта, при этом аллельный вариант кодирует полипептид, который не придает устойчивости к Cercospora beticola.
16. Способ по п.15, отличающийся тем, что чувствительный аллельный вариант содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из
(a) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 6,
(b) нуклеотидной последовательности, содержащей последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 5,
(c) нуклеотидной последовательности, содержащей последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 4,
(f) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 6, или
(g) нуклеотидной последовательности, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5.
17. Способ идентификации растения подвида Beta vulgaris subsp. vulgaris, устойчивого к Cercospora beticola, отличающийся тем, что способ включает, по меньшей мере, этап (i) или (ii):
(i) определение присутствия и/или экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты по п.1, или присутствия полипептида по п.2, в растении или части растения; и/или
(ii) определение по меньшей мере одного маркерного локуса, который:
(а) содержит маркер, имеющий последовательность SEQ ID NO: 65, и маркер, имеющий последовательность SEQ ID NO: 63, и фланкирован им, или
(б) содержит последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 74 или SEQ ID NO: 75 в нуклеотидной последовательности молекулы нуклеиновой кислоты по п.1.
18. Способ идентификации по п.17, который включает отбор растения.
19. Способ по пп.17 и 18, который включает этап (ii) определение по меньшей мере одного маркерного локуса, который:
(а) содержит маркер, имеющий последовательность SEQ ID NO: 65, и маркер, имеющий последовательность SEQ ID NO: 63, и фланкирован им, или
(б) содержит последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 74 или SEQ ID NO: 75 в нуклеотидной последовательности молекулы нуклеиновой кислоты по п.1 или в косегрегационной области, при этом, чтобы косегрегационная область представляла собой геномную область в Beta vulgaris subsp. vulgaris, которая косегрегирует с устойчивостью к Cercospora beticola, придаваемой полипептидом по п.2, или с молекулой нуклеиновой кислоты по п.1.
20. Способ по пп.17-19, в котором на этапе (ii) косегрегирующая область
a) содержала и фланкировалась маркером, имеющим последовательность SEQ ID NO: 65, и маркером, имеющим последовательность SEQ ID NO: 63, или
b) содержала аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 74 и/или 75.
21. Способ по пп.17-20, который содержит этап (iii) отбор растения, устойчивого к Cercospora beticola.
22. Способ культивирования растений вида Beta vulgaris subsp. vulgaris, включающий
(i) предложение растений по п.5, продуцирование растений вида Beta vulgaris subsp. vulgaris с помощью способа по одному из пп.9-16, или идентификацию и отбор растений подвида Beta vulgaris subsp. vulgaris c помощью способа по п.16, и
(ii) культивирование растений из пункта (i) или их потомков, отличающийся тем, что способ предотвращает заражение культивируемых растений Cercospora beticola.
23. Олигонуклеотид, состоящий из по меньшей мере 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидов в длину, при этом олигонуклеотид специфически гибридизируется с идентичностью последовательности по меньшей мере на 90% с одним из следующих:
(a) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 3;
(b) нуклеотидной последовательности, которая содержит последовательность ДНК в соответствии с SEQ ID NO: 2;
(c) нуклеотидной последовательности, содержащей последовательность ДНК в соответствии с идентификатором SEQ ID NO: 1 или идентификатором SEQ ID NO: 53;
(f) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 98% соответствует аминокислотной последовательности согласно SEQ ID NO: 3; или
(g) нуклеотидной последовательности, которая по меньшей мере на 98% идентична последовательности ДНК в соответствии с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.
24. Олигонуклеотид по п.23, состоящий из по меньшей мере 21, 22, 23, 24 или 25 нуклеотидов в длину, при этом олигонуклеотид специфически гибридизируется с идентичностью последовательности по меньшей мере на 90% с одним из следующих:
(a) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 3;
(b) нуклеотидной последовательности, которая содержит последовательность ДНК в соответствии с SEQ ID NO: 2;
(c) нуклеотидной последовательности, содержащей последовательность ДНК в соответствии с идентификатором SEQ ID NO: 1 или идентификатором SEQ ID NO: 53;
(f) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 98% соответствует аминокислотной последовательности согласно SEQ ID NO: 3; или
(g) нуклеотидной последовательности, которая по меньшей мере на 98% идентична последовательности ДНК в соответствии с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.
25. Олигонуклеотид по п.24, состоящий из по меньшей мере 30, 35, 40, 45 или 50 нуклеотидов в длину, при этом олигонуклеотид специфически гибридизируется с идентичностью последовательности по меньшей мере на 90% с одним из следующих:
(a) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 3;
(b) нуклеотидной последовательности, которая содержит последовательность ДНК в соответствии с SEQ ID NO: 2;
(c) нуклеотидной последовательности, содержащей последовательность ДНК в соответствии с идентификатором SEQ ID NO: 1 или идентификатором SEQ ID NO: 53;
(f) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 98% соответствует аминокислотной последовательности согласно SEQ ID NO: 3; или
(g) нуклеотидной последовательности, которая по меньшей мере на 98% идентична последовательности ДНК в соответствии с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.
26. Олигонуклеотид по п.25, состоящий из по меньшей мере 100, 200, 300 или 500 нуклеотидов в длину, при этом олигонуклеотид специфически гибридизируется с идентичностью последовательности по меньшей мере на 90% с одним из следующих:
(a) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 3;
(b) нуклеотидной последовательности, которая содержит последовательность ДНК в соответствии с SEQ ID NO: 2;
(c) нуклеотидной последовательности, содержащей последовательность ДНК в соответствии с идентификатором SEQ ID NO: 1 или идентификатором SEQ ID NO: 53;
(f) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 98% соответствует аминокислотной последовательности согласно SEQ ID NO: 3; или
(g) нуклеотидной последовательности, которая по меньшей мере на 98% идентична последовательности ДНК в соответствии с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2c.
27. Способ продуцирования растения или клетки, содержащего мутированную версию молекулы нуклеиновой кислоты по п.1 и/или мутированную версию промотора, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из
(a) SEQ ID NO: 7,
(с) нуклеотидной последовательности, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности, в соответствии с SEQ ID NO: 7,
отличающийся тем, что способ включает следующие этапы:
(I) предложение растения или клетки, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты и/или промотор,
(II) увеличение частоты мутаций растения или клетки, или мутагенеза растения, или клетки,
(III) фенотипический отбор растения или клетки, который в результате мутации демонстрирует измененную устойчивость или измененный уровень устойчивости к Cercospora beticola, или генотипический отбор растения или клетки, содержащей мутацию в молекуле нуклеиновой кислоты и/или промотор, при этом мутация была создана на этапе (II).
28. Способ продуцирования растения или клетки по п.27, отличающийся тем, что содержит этап (IV) регенерации растения из клетки, полученной на этапе (III).