(57) 1. Гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с CD47 человека, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13.
2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой изотип IgG1.
3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1 или 2, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент обладают
(i) повышенной антитело-зависимой клеточной цитотоксичностью (ADCC) по сравнению с исходным антителом, и/или
(ii) повышенным антителозависимым клеточным фагоцитозом (ADCP) по сравнению с исходным антителом, и/или
(iii) повышенной комплемент-зависимой цитотоксичностью (CDC) по сравнению с их исходным антителом.
4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-3, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой Fab, Fab', F(ab')₂, фрагмент Fv, диатело, одноцепочечное антитело, фрагмент scFv или scFv-Fc.
5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-4, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент индуцируют апоптоз клеток, экспрессирующих CD47, in vitro и/или in vivo.
6. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-5, имеющие пониженное фукозилирование остова по сравнению с исходным антителом или которые являются афукозилированными.
7. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент блокируют взаимодействие между CD47 и SIRPa.
8. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-7, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеют пониженную гемагглютинацию эритроцитов по сравнению с Ab47, содержащим вариабельную область тяжелой цепи с SEQ ID NO: 2 и вариабельную область легкой цепи с SEQ ID NO: 10.
9. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-8.
10. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по п.9.
11. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.9 или вектор экспрессии по п.10.
12. Клетка-хозяин, которая экспрессирует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-8.
13. Способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-8, включающий культивирование клетки-хозяина по п.11 или 12.
14. Способ по п.13, дополнительно включающий выделение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
15. Композиция для индукции апоптоза клетки, экспрессирующей CD47, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-8.
16. Композиция по п.15, в которой клетки находятся in vitro.
17. Композиция по п.15, в которой клетки находятся in vivo.
18. Экранированное антитело, содержащее антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-8 и по меньшей мере один экранирующий домен.
19. Экранированное антитело по п.18, где по меньшей мере один экранирующий домен содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 44-55, 75-86, 94 и 95.
20. Экранированное антитело по п.18 или 19, где по меньшей мере один экранирующий домен снижает аффинность связывания антитела или антигенсвязывающего фрагмента с белком CD47 человека по сравнению с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом без по меньшей мере одного экранирующего домена.
21. Экранированное антитело по п.20, где аффинность связывания снижается по меньшей мере в около 100 раз или от около 200 раз до около 1500 раз по сравнению с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом без по меньшей мере одного экранирующего домена.
22. Экранированное антитело по любому из пп.18-21, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат тяжелую цепь и легкую цепь, где
тяжелая цепь связана с первым экранирующим доменом; или где
легкая цепь связана со вторым экранирующим доменом; или где
тяжелая цепь связана с первым экранирующим доменом и легкая цепь связана со вторым экранирующим доменом.
23. Экранированное антитело по п.22, где
первый экранирующий домен содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 44, 46, 48, 50, 52, 54, 75, 77, 79, 81, 83, 85 и 94; и
второй экранирующий домен содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 45, 47, 49, 51, 53, 55, 76, 78, 80, 82, 84, 86 и 95.
24. Экранированное антитело по п.23, где первый экранирующий домен и второй экранирующий домен представляют собой пару экранирующих доменов, выбранных из SEQ ID NO: 44 и 45; SEQ ID NO: 46 и 47; SEQ ID NO: 48 и 49; SEQ ID NO: 50 и 51; SEQ ID NO: 52 и 53; SEQ ID NO: 54 и 55; SEQ ID NO: 75 и 76; SEQ ID NO: 77 и 78; SEQ ID NO: 79 и 80; SEQ ID NO: 81 и 82; SEQ ID NO: 83 и 84; SEQ ID NO: 85 и 86; и SEQ ID NO: 94 и 95.
25. Экранированное антитело по любому из пп.22-24, где первый экранирующий домен связан с N-концом тяжелой цепи и второй экранирующий домен связан с N-концом легкой цепи.
26. Экранированное антитело по любому из пп.22-25, где каждый экранирующий домен содержит расщепляемый протеазой линкер и связан с тяжелой цепью или легкой цепью через расщепляемый протеазой линкер.
27. Экранированное антитело по п.26, где расщепляемый протеазой линкер содержит сайт расщепления матриксной металлопротеазой (ММР).
28. Экранированное антитело по п.27, где сайт расщепления ММР выбран из сайта расщепления ММР2, сайта расщепления ММР7, сайта расщепления ММР9 и сайта расщепления ММР13.
29. Экранированное антитело по п.27 или 28, где после расщепления с помощью ММР тяжелая цепь и/или легкая цепь антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит фрагмент из аминокислотных остатков сайта расщепления ММР.
30. Экранированное антитело по п.29, где фрагмент из аминокислотных остатков сайта расщепления содержит последовательность LRSG, SG или VR на N-конце антитела.
31. Экранированное антитело по любому из пп.18-30, содержащее тяжелую цепь, связанную с первым экранирующим доменом и имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, и легкую цепь, связанную со вторым экранирующим доменом и имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43.
32. Нуклеиновая кислота, кодирующая экранированное антитело по любому из пп.18-31.
33. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по п.32.
34. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.32 или вектор экспрессии по п.33.
35. Клетка-хозяин, которая экспрессирует экранированное антитело по любому из пп.18-31.
36. Способ получения экранированного антитела по любому из пп.18-31, включающий культивирование клетки-хозяина по п.34 или 35.
37. Способ по п.36, дополнительно включающий выделение экранированного антитела.
38. Композиция для лечения CD47-экспрессирующего онкологического заболевания у пациента, содержащая анти-CD47 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-8 или экранированное антитело по любому из пп.18-31.
39. Композиция для лечения CD40-экспрессирующего онкологического заболевания у пациента, содержащая экранированное антитело по любому из пп.18-31,
где пациент идентифицирован как имеющий повышенные уровни ММР в опухоли по сравнению с окружающей тканью, не являющейся раковой; и
где каждый экранирующий домен экранированного антитела содержит расщепляемый протеазой линкер, где расщепляемый протеазой линкер содержит сайт расщепления матриксной металлопротеазой (ММР).
40. Композиция по п.39, где ММР выбран из ММР2, ММР7, ММР9 и ММР13.
41. Композиция по п.39 или 40, где сайт расщепления ММР выбран из сайта расщепления ММР2, сайта расщепления ММР7, сайта расщепления ММР9 и сайта расщепления ММР13.
42. Композиция по любому из пп.39-41, где идентификация включает
i) взятие у пациента раковой ткани и ткани, не являющейся раковой;
ii) обнаружение ММР в выделенной раковой ткани и в ткани, не являющейся раковой; и
iii) сравнение количественной оценки окрашивания в раковой ткани по сравнению с тканью, не являющейся раковой.
43. Композиция по п.38, где пациент идентифицирован как имеющий CD47-экспрессирующее онкологическое заболевание, которое характеризуется экспрессией CD47.
44. Композиция по п.43, в которой идентификация включает
i) взятие раковой ткани; и
ii) обнаружение CD47 в выделенной раковой ткани.
45. Композиция по п.38, где пациент идентифицирован как имеющий повышенные уровни инфильтрации макрофагов в раковой ткани по сравнению с тканью, не являющейся раковой.
46. Композиция по п.45, где идентификация включает
i) взятие у пациента раковой ткани и окружающей ткани, не являющейся раковой;
ii) обнаружение макрофагов в выделенной раковой ткани и в ткани, не являющейся раковой; и
iii) сравнение количественной оценки окрашивания в раковой ткани по сравнению с тканью, не являющейся раковой.
47. Композиция по п.46, где окрашивание макрофагов проводят с использованием антитела против CD163.
48. Композиция по любому из пп.38-47, где онкологическое заболевание, характеризующееся экспрессией CD47, представляет собой гемобластоз или солидный рак.
49. Композиция по любому из пп.38-48, где CD47-экспрессирующее онкологическое заболевание выбрано из неходжкинской лимфомы, В-лимфобластной лимфомы; В-клеточного хронического лимфоцитарного лейкоза/лимфомы из малых лимфоцитов, синдрома Рихтера, фолликулярной лимфомы, множественной миеломы, миелофиброза, истинной полицитемии, Т-клеточной лимфомы кожи, моноклональной гаммапатии неустановленной этиологии (MGUS), миелодиспластического синдрома (MDS), иммунобластной крупноклеточной лимфомы, В-лимфобластного лейкоза из клеток-предшественников, острого миелоидного лейкоза (AML) и анапластической крупноклеточной лимфомы.
50. Композиция по любому из пп.38-48, где CD47-экспрессирующее онкологическое заболевание выбрано из рака легких, рака поджелудочной железы, рака молочной железы, рака печени, рака яичника, рака яичка, рака почки, рака мочевого пузыря, рака позвоночника, рака головного мозга, рака шейки матки, рака эндометрия, колоректального рака, рака анального канала, рака пищевода, рака желчного пузыря, рака желудочно-кишечного тракта, рака желудка, саркомы, рака головы и шеи, меланомы, рака кожи, рака простаты, рака гипофиза, рака матки, рака влагалища и рака щитовидной железы.
51. Композиция по п.50, где CD47-экспрессирующее онкологическое заболевание выбрано из рака легких, саркомы, колоректального рака, рака головы и шеи, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака желудка, меланомы и рака молочной железы.
52. Композиция по любому из пп.38-51, где композицию вводят в комбинации с ингибитором молекулы иммунной контрольной точки, выбранной из одного или более из: белка запрограммированной смерти клетки 1 (PD-1), лиганда запрограммированной смерти клетки 1 (PD-L1), PD-L2, цитотоксического Т-лимфоцит-ассоциированного белка 4 (CTLA-4), белка 3, содержащего домены Т-клеточного иммуноглобулина и муцина (TIM-3), гена активации лимфоцитов 3 (LAG-3), карциномоэмбриональной антигензависимой молекулы клеточной адгезии 1 (СЕАСАМ-1), СЕАСАМ-5, V-доменного иммуноглобулинового супрессора активации Т-клеток (VISTA), В- и Т-лимфоцитарного аттенюатора (BTLA), Т-клеточного иммунорецептора с доменами Ig и ITIM (TIGIT), иммуноглобулино-подобного рецептора, ассоциированного с лейкоцитами (типа 1) (LAIR1), CD160, 2В4 или TGFR.
53. Композиция по любому из пп.38-52, где композицию вводят в комбинации с агонистическим антителом против CD40.
54. Композиция по п.53, где агонистическое антитело против CD40 имеет низкие уровни фукозилирования или является афукозилированным.
55. Композиция по любому из пп.38-54, где композицию вводят в сочетании с конъюгатом антитело-лекарственное средство (ADC), где антитело ADC специфически связывается с белком, который экспрессируется на внеклеточной поверхности раковой клетки и антитело конъюгировано с соединением линкер-лекарственное средство, содержащим цитотоксический агент.
56. Композиция по п.55, где цитотоксический агент представляет собой ауристатин.
57. Композиция по п.56, где антитело ADC конъюгировано с соединением линкер-лекарственное средство, выбранным из группы, состоящей из vcMMAE и mcMMAF.
58. Композиция по любому из пп.38-57, где экранированное антитело содержит по меньшей мере один экранирующий домен, содержащий расщепляемый протеазой линкер, отличающийся тем, что расщепляемый протеазой линкер расщепляется в микроокружении опухоли.
59. Композиция по п.58, где после расщепления пригодного для расщепления протеазой линкера в микроокружении опухоли экранирующий домен высвобождается из антитела против CD47 или его антигенсвязывающего фрагмента.
60. Композиция по п.58 или 59, где расщепляемый протеазой линкер содержит аминокислотную последовательность IPVSLRSG (SEQ ID NO: 73) или GPLGVR (SEQ ID NO: 57).
61. Композиция по любому из пп.58-60, где расщепляемый протеазой линкер содержит сайт расщепления ММР.
62. Композиция по п.61, где сайт расщепления ММР выбран из группы, состоящей из сайта расщепления ММР2, сайта расщепления ММР7, сайта расщепления ММР9 и сайта расщепления ММР13.
63. Композиция по любому из пп.58-62, где после расщепления в микроокружении опухоли высвободившееся антитело против CD47 или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с CD47 с аффинностью, которая по меньшей мере в около 100 раз выше, от 200 раз до 1500 раз выше аффинности экранированного антитела к CD47.
64. Композиция по любому из пп.38-63, где антитело против CD47 или его антигенсвязывающий фрагмент или антитело против CD47 или его антигенсвязывающий фрагмент экранированного антитела проявляют пониженную гемагглютинацию in vitro no сравнению с исходным антителом против CD47.
65. Композиция по п.64, где исходное антитело представляет собой Ab47, содержащее вариабельную область тяжелой цепи с SEQ ID NO: 2 и вариабельную область легкой цепи с SEQ ID NO: 10.
66. Композиция по любому из пп.38-65, где введение антитела против CD47 или его антиген-связывающего фрагмента или экранированного антитела не вызывает гемагглютинацию у пациента.
67. Композиция по любому из пп.38-66, где антитело против CD47, или его антигенсвязывающий фрагмент, или экранированное антитело вызывает апоптоз клеток, экспрессирующих CD47, in vitro и/или in vivo.
68. Композиция по п.67, где клетки, экспрессирующие CD47, представляют собой раковые клетки.

---