Евразийский сервер публикаций

Евразийский патент № 045469

   Библиографические данные
(11)045469    (13) B1
(21)202190311

 A ]   B ]   C ]   D ]   E ]   F ]   G ]   H ] 

Текущий раздел: C     


Документ опубликован 2023.11.28
Текущий бюллетень: 2023-11  
Все публикации: 045469  
Реестр евразийского патента: 045469  

(22)2019.09.05
(51) C07K 14/42 (2006.01)
C07K 14/47 (2006.01)
C12P 21/02(2006.01)
(43)A1 2021.10.27 Бюллетень № 10  тит.лист, описание  последовательности 
(45)B1 2023.11.28 Бюллетень № 11  тит.лист, описание  последовательности 
(31)201821008382; 201921001559
(32)2018.09.07; 2019.01.14
(33)IN; IN
(86)IB2019/057471
(87)2020/074977 2020.04.16
(71)ЮНИКЕМ ЛАБОРАТОРИС ЛИМИТЕД (IN)
(72)Сате Дхананджай, Кумар Судип, Катдаре Мамата (IN)
(73)ЮНИКЕМ ЛАБОРАТОРИС ЛИМИТЕД (IN)
(74)Сагитов В.Р. (RU)
(54)УЛУЧШЕННЫЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ЛЕКТИНА
   Формула 
(57) 1. Способ получения рекомбинантного белка лектина, который включает экспрессию рекомбинантного белка лектина, кодируемого рекомбинантным геном лектина, в культуре клетке-хозяина, при этом:
a) указанная клетка-хозяин представляет собой рекомбинантную клетку E.coli, a экспрессию осуществляют в условиях, при которых время удвоения указанной клетки составляет от 100 до 160 мин;
b) экспрессию проводят при температуре по меньшей мере от 15 и до не более чем 22°C, и при этом отношение углерода к азоту во время указанной фазы экспрессии поддерживают на уровне от 3:1 до 6:1, а рекомбинантный белок лектин выбран из:
i) SEQ ID NO:1;
ii) SEQ ID NO:3;
iii) SEQ ID NO:4 или
iv) последовательности аминокислот, по меньшей мере на 60, 70, 80, 90, 95, 97, 98 или 99% гомологичной i), ii) или iii);
c) фазу экспрессии (т.е. индукции) проводят в течение по меньшей мере 10 ч, а оптическая плотность культуры составляет не менее 25 и не более 40;
d) в культуру добавляют источник углерода из расчета от 0,5 до 2 г л-1ч-1;
e) в культуру добавляют источник азота из расчета от 0,4 до 1,5 г л-1ч-1;
f) концентрация индуктора составляет по меньшей мере 0,1 и не более 0,5 мМ, причем указанным индуктором является IPTG (изопропил-тиогалактопиранозид);
g) очистка неочищенного рекомбинантного белка лектина включает по меньшей мере один хроматографический этап.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что культура клеток-хозяев имеет объем по меньшей мере 10 л.
3. Способ по любому из пп.1, 2, отличающийся тем, что культивирование клеток-хозяев включает фазу роста, во время которой указанную клетку-хозяина культивируют до экспрессии белка; и фазу экспрессии, во время которой осуществляют экспрессию белка, причем указанную фазу роста проводят при температуре, превышающей температуру, при которой проводят указанную фазу экспрессии, и причем указанную температуру снижают при переходе от указанной фазы роста к указанной фазе экспрессии в течение периода, составляющего по меньшей мере 4 и не более 7 ч.
4. Способ по любому из пп.1-3, при этом указанный способ дополнительно включает:
a) необязательно, клонирование рекомбинантного гена лектина в экспрессионный вектор и инсерцию указанного экспрессионного вектора в клетку-хозяина;
b) культивирование указанной клетки-хозяина в подходящей среде, при этом указанное культивирование включает фазу роста, которую проводят при температуре от 25 до 40°C, и фазу экспрессии, во время которой экспрессируется указанный рекомбинантный белок лектин, кодируемый указанным рекомбинантным геном лектина;
c) необязательно, выделение указанного рекомбинантного белка лектина, экспрессированного на этапе (b), с получением неочищенного рекомбинантного белка лектина путем центрифугирования с последующим разрушением клеточной поверхности; и
d) необязательно, очищение указанного неочищенного рекомбинантного белка лектина с получением изолята рекомбинантного белка лектина.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что источник углерода представляет собой глюкозу или глицерин, а источник азота представляет собой триптон, пептон или дрожжевой экстракт.
6. Способ по п.4, отличающийся тем, что очищение указанного неочищенного рекомбинантного белка лектина на этапе "d" включает по меньшей мере один хроматографический этап, выбранный из анионообменной хроматографии, катионообменной хроматографии или хроматографии гидрофобного взаимодействия.
7. Способ по п.4, отличающийся тем, что очищение указанного неочищенного рекомбинантного белка лектина на этапе "d" включает этап фильтрации.
8. Способ по любому из пп.1-4, дополнительно включающий очищение неочищенного рекомбинантного белка лектина способом, включающим:
a) начальное очищение неочищенного рекомбинантного белка лектина путем анионообменной хроматографии с получением первого очищенного элюата;
b) необязательное очищение указанного первого очищенного элюата хроматографией с гидрофобным взаимодействием с получением второго очищенного элюата;
c) необязательное очищение указанного второго очищенного элюата путем катионообменной хроматографии с получением третьего очищенного элюата;
d) дополнительное очищение указанного первого, второго или третьего очищенного элюата путем анионообменной хроматографии с получением четвертого очищенного элюата и
e) замену буфера указанного четвертого очищенного элюата путем диафильтрации с получением очищенного изолята рекомбинантного белка лектина.